AKT I
Do rzymskiego kościoła Sant’ Andrea della Valle wbiega mężczyzna. To Cesare Angelotti, konsul upadłej Republiki rzymskiej, który właśnie zbiegł z więzienia Zamku Świętego Anioła. Dzięki swojej siostrze znajduje ukryty klucz do kaplicy Attavantich, po czym się w niej ukrywa.
Zaraz po tym, niczego nieświadomy Zakrystian wyszedł odmówić Anioł Pański. Po modlitwie wita malarza Maria Cavaradossiego, który właśnie pracuje nad obrazem Marii Magdaleny. Zakrystian natychmiast rozpoznaje w tym wizerunku twarz nieznajomej kobiety, która często przychodzi modlić się pod figurą Matki Bożej. Uważa, że ten obraz to świętokradztwo. Zostawiając malarzowi koszyk z prowiantem, odchodzi.
Cesare Angelotti wychodzi z kaplicy, by przywitać się z malarzem, jednak szybko znów się ukrywa, bo z oddali dobiega głos kobiety. To Floria Tosca – ukochana Mario Cavaradossiego. Przybyła tu, aby umówić się z nim na wieczór. Wyczuwa jednak w kościele czyjąś obecność i pod wpływem zazdrości postanowiła przesłuchać Cavaradossiego. Malarz musi również wyjaśnić podobieństwo Marii Magdaleny z obrazu do Markizy Attavanti (siostry Cesare Angelottiego). Uspokojona Tosca odchodzi, a Cavaradossi wypuszcza zbiega. Odgłos armaty świadczy o wykrytej ucieczce z więzienia. Malarz daje przyjacielowi klucz do swego domu i wskazuje na kryjówkę w wyschniętej studni w ogrodzie.
Zakrystian przynosi wiadomość o klęsce Bonapartego. To wydarzenie będzie uczczone wieczornym koncertem w pałacu Farnese z udziałem wspaniałej śpiewaczki – Florii Toski. Wszyscy się radują. Nagle w kościele zjawia się komendant rzymskiej policji – baron Scarpia. Przeszukuje świątynię, a w kaplicy Attavantich odnajduje koszyk z jedzeniem, świadczący o obecności zbiega. W kościele zjawia się ponownie zazdrosna Tosca. Baron Scarpia pożąda jej od dawna, dlatego też rozwinął przy niej znaleziony wachlarz Markizy Attavanti, by rzucić cień podejrzeń na wierność Cavaradossiego. Tosca w rozpaczy wybiega za ukochanym, by złapać go na gorącym uczynku, a Scarpia przyłącza się do uroczystego Te Deum.
AKT II
Baron Scarpia spożywa kolację w swoim pałacu. Zza okna dobiega muzyka z koncertu, podczas którego lud cieszy się zwycięstwem Melasa nad Bonapartem. Spoletta, zaufany współpracownik barona, przynosi informację o aresztowaniu Cavaradossiego, gdyż w willi malarza nie znaleziono zbiega Angelottiego. Scarpia bezskutecznie przesłuchuje podejrzanego Maria Cavaradossiego. Przychodzi zdenerwowana Tosca i czule wita ukochanego, lecz ten na rozkaz barona zostaje przeniesiony na przesłuchanie do bocznej komnaty. Rozpoczynają się jego tortury, a Tosca próbuje przekonać Scarpię niewinności malarza. Po pewnym czasie, nie mogąc znieść odgłosów tortur, Floria ulega i wyjawia kryjówkę Cesare Angelottiego. Wprowadzają umęczonego artystę, lecz ten, gdy dowiedział się o zdradzie Toski, odpycha ją. W tym samym czasie Sciarrone przynosi wiadomość jednak o klęsce Melasa i ostatecznej wygranej Bonapartego. Scarpia wpada w gniew i skazuje malarza na karę śmierci.
Tosca i Scarpia zostają sam na sam. Śpiewaczka pyta o wysokość sumy, za którą może wykupić ukochanego z więzienia. Baron ze śmiechem stwierdza, że pożąda jej samej. Początkowo Floria nie dopuszcza takiej myśli, jednak na wiadomość o samobójstwie Angelottiego, zmienia zdanie, stawiając warunki. Tosca żąda zwolnienia Cavaradossiego oraz listu żelaznego do granicy. Baron przystaje na warunki, jednak zasłaniając się reputacją, mówi że egzekucja musi się odbyć, lecz będzie pozorowana. Na hasło „Jak to zrobiliśmy z hrabią Palmieri” wierny Spoletta wie, co ma robić. Scarpia podpisuje zwolnienie oraz list, po czym rzuca się na Toskę. Śpiewaczka jednak wpycha nóż prosto w jego serce i ucieka z dokumentami.
AKT III
Ciszę poranka na tarasie Zamku Świętego Anioła rozprasza głos Pastuszka. Mario Cavaradossi czeka na egzekucję. Artysta prosi strażnika, by ten przekazał list drogiej mu osobie. Spoletta przyprowadza Toskę do Maria. Floria wszystko mu tłumaczy i razem snują plany na wspólną szczęśliwą przyszłość. Przyszedł czas na wyrok. Żołnierze strzelają, a Cavaradossi upada. Po chwili Tosca podbiega do niego, by utrzymać pozory prawdziwej egzekucji. Jednak w objęciach trzyma martwe ciało ukochanego. Spoletta i Sciarone odkryli morderstwo Scarpii i próbują dopaść Toskę. Ta jednak zrozpaczona rzuca się z krawędzi tarasu z okrzykiem: „Scarpio, przed Bogiem się spotkamy!”.
